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兽医体外诊断的趋势--分子诊断

摘要: 宠物已成为现代人的重要家庭成员,围绕其吃穿用度、生老病死,形成了一条千亿级的“经济”产业链。其中,需求刚性大、消费支出高的宠物医疗更占据了产业链中的核心地位,成了宠物消费中的“大头”。宠物医疗服务包括 ...

 

 

       宠物已成为现代人的重要家庭成员,围绕其吃穿用度、生老病死,形成了一条千亿级的“经济”产业链。其中,需求刚性大、消费支出高的宠物医疗更占据了产业链中的核心地位,成了宠物消费中的“大头”。

宠物医疗服务包括为宠物提供疾病诊疗和日常保健服务,是宠物行业中仅次于宠物食品的第二大细分行业。按疾病种类划分,宠物医疗服务包括宠物外科疾病、内科疾病、皮肤病、传染病诊疗及宠物免疫等。传染病是由某些具有致病性的微生物,如细菌、病毒等引起的,能够在某种动物或多种动物之间传播的一些疾病。养好宠物的关键是疾病的防治,尤其是一些传染病,其发病急、传播快,对动物的健康威胁极大。

 

在随着人们生活质量的逐渐提升,犬猫在人们生活中扮演角色也日渐重要。并且,随着饲主的观念和宠物医疗质量的逐年提升,在动物疾病的诊断的准确度上,也从以前的「盲人摸象」逐渐走向分子诊断的水平。

 

目前,分子诊断技术以其具有的灵敏度高、特异性强、简便快速、可进行定性、定量检测等优势,已广泛应用于感染性疾病(包括细菌性感染、病毒性感染、寄生虫、真菌、人畜共患疾病等)、肿瘤等多个领域。分子诊断的检测结果对临床医疗决策的贡献度进一步提升,检验结果的重要性也达到空前的高度。

在宠物传染病检测技术方面,分子诊断核酸检测方法同样具有极高的灵敏度和特异性,可最大程度缩短传染病检测的窗口期。该方法也是人类传染病临床确诊的黄金方法。

其中以PCR为代表技术的是当前分子诊断最常用的方法。PCR技术是用一对寡聚DNA作为引物,通过变性-退火-延伸这一周期多次循环,使目的DNA得到扩增,具有高灵敏性和高特异性的优势。

 

 

而实时荧光定量PCR实现了PCR从定性到定量的质的飞跃,实时荧光定量PCR技术(将荧光基团加入到PCR反应体系中,借助荧光信号,累积实时监测整个PCR的进程)不仅具有传统PCR的优势,还具有特异性强、灵敏度高、重复性好、反应速度快、定量准确和自动化程度高等特点,成为国际公认的核酸分子定量的标准方法。

实时荧光定量PCR可以早期、精准的诊断宠物疾病

在目前的宠物临床工作中,广泛存在着对一部分病原诊断困难或者不能精确诊断的问题。具体表现在以下几个方面:

1、现有的诊断技术灵敏度低

如:常见用于病毒诊断的胶体金试纸。虽然胶体金试纸可以提供快速诊断,但是该种方法是从蛋白水平对病原进行检测,存在一定的交叉反应和动物自身抗体干扰,导至临床应用的过程中出现假阳性和假阴性的结果;

2、疾病的早期诊断(如潜伏期)和抗原要求较高的疾病

如:使用传统的诊断技术(胶体金试纸和ELISA检测方法)无法提供准确的诊断依据。如临床上常见犬瘟热和细小病毒;

3、临床上有很多的病原没有商品化的便捷的试剂商业化生产

这一部分的病原诊断(如猫传染性腹膜炎)目前在兽医临床工作中还不能做到在医院内诊断。如果需要做血涂片、粪检的疾病,导至主观性较强,易产生漏检的现象;

4、在疫病防治过程中

如注射疫苗是预防犬猫病毒性疾病的主要措施,但是血清学检测出的抗体很难区别是疫苗免疫还是病毒感染产生的,而PCR能够精准的检测病原体;

5、临床上还有一些病原在微量时存在诊断困难的情况

如小巴贝斯虫等疾病。

因此PCR(尤其是实时荧光定量PCR)使这些疾病的精准诊断成为现实。

农业部《2013年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》的要求,以及我国现行的宠物疾病诊断国家标准中颁布了《犬细小病毒诊断技术(GB/T27533-2011)》和《犬瘟热诊断技术(GB/T27532-2011)》国家技术标准,明确将犬细小病毒和犬瘟热病毒核酸检测(而非试纸卡检测)作为诊断标准,这也说明核酸检测在动物疫病诊断中的重要地位。

 

 

选择一款合适的PCR产品对于宠物的诊断尤为重要

在临床工作中,目前有很多PCR供兽医师们选择,有核酸免提取的、有等温扩增的、有液体试剂和冻干试剂的、有全自动PCR,让兽医师们无从选择,到底应该怎样客观的看待这些,做到科学的选择呢,接下来会详细的阐述。

核酸免提取会导至假阴性的概率增加

核酸提取是分子诊断实验的“第一步”,是十分重要的环节,因为首先必须把宠物样品中的核酸提取出来,才能进行后续的检测,可见核酸提取的重要性。核酸提取具有两大目的:提纯(消除样本中干扰物质)和浓缩(提高样本中核酸浓度)。因为,对于PCR所检测样品(血清、全血、细胞保存液和粪便等)中有很多干扰物和抑制物,核酸含量低,直接检测核酸难度高,灵敏度差。因此检测之前,需要将样品中的核酸裂解,提纯并浓缩,也就是核酸提取。这是业界的主流做法。

比如临床上一些鼻咽拭子和口腔拭子的洗脱液,成分很简单,几乎是生理盐水+少量分泌物+大量游离的病毒,可以不进行核酸提取直接扩增。猫的疱疹病毒FHV-1用拭子在口鼻采样就能检出。如果拭子的洗脱液比较干净,可以省去提纯这一步,但是不经过浓缩,降低了检测的灵敏度。

此外,复杂样本必须要进行核酸提取。比如猫的冠状病毒(FCoV)大多检测的是猫的腹水,腹水样本非常粘稠,里面蛋白很多,无法直扩检测。这种样本免提取直接扩增就不是灵敏度下降的问题了,而是无法检测出来的问题。

等温扩增成本高、较多产品有专利保护的缺点

等温扩增仪器简单,检测时间快,检测灵敏度与PCR相仿。但等温扩增技术多为外国发明,现在还都在专利保护期内,应用尚不普及,相对来说成本也较高。

真空冻干技术具有诸多优点,是PCR试剂的趋势

PCR的试剂成分包括纯化水、引物、聚合酶、Mg2+dNTP和探针等成分。这些成分混合后,常温下会逐渐降解失效。所以液体PCR试剂需要分装到不同的小瓶-20℃保存,用时再解冻配制。因此,试剂的储运和操作都比较麻烦。

而真空冻干技术可将试剂内部的水分完全升华掉,同时不破坏有效成分。冻干之后的试剂可以常温保存,无需冷链运输。使用时加入水就能溶解,然后像正常的PCR试剂使用,因此是PCR试剂的趋势。

而我们苏州先达基因,拥有完全独立自主知识产权的酶促重组等温扩增技术(ERA技术),通过基因工程对重组酶、外切酶、聚合酶等多酶体系进行改造,建立特殊扩增反应体系,在30-42℃恒温条件下,20分钟内,可将微量DNA/RNA的特异性区段在数分钟内扩增109倍,从而达到可检出水平。该技术具备PCR扩增的特异性和恒温扩增LAMP技术的便捷性,准确度极高。

具有可检测性、灵敏性、快速性以及特异性等优点,反应组分已经混合好并冷冻干燥成干粉状态,操作简便,易于保存。且全程自产,相对价格也更有优势。同时配合其荧光恒温扩增仪,可以实现核酸现场检测,不再局限场地、时间或者人员。

分子诊断作为体外诊断技术的第四次革命,应用分子生物学方法,检测患者(宠物)体内遗传物质结构或表达水平的变化,继而作出诊断的技术,它为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供了更为准确的信息。较其他检测方法相比具有不可比拟的优势。而PCR作为分子诊断最常用的检测方法,在宠物的临床诊断中也会越来越重要。同时也相信我们先达基因的恒温扩增核酸检测技术,凭借其检测快速、价格低廉等优势,在及时现场检测市场中会脱颖而出。

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